介绍FFPE处理样本的特点
介绍FFPE处理样本的特点。
FFPE主要造成DNA链内和链间交联，以及大量链断裂和碱基修饰。
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样本：
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新鲜T47D乳腺细胞：培养后沉淀，随后立即提取DNA
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FFPE T47D乳腺细胞：悬浮在10%中性缓冲甲醛（NBF）中在室温下固定1小时。然后离心，去除甲醛，加入70%乙醇，混合并静置过夜。接下来，通过在室温下依次使用乙醇（70%，95%，100%，100%）浓度逐渐升高的浸泡1小时45分钟，最后在室温下用二步骤的1小时45分钟的二甲苯中脱水。然后向沉淀中添加液体石蜡，并在60°C（石蜡熔点）保持，每20分钟更换一次，以确保去除残留的二甲苯。然后在室温下让沉淀在新鲜的石蜡中固化，然后植入一个新的石蜡块中，从中切割出用于从FFPE细胞提取DNA的切片。
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冻存T47D乳腺细胞：细胞新鲜冷冻的T47D细胞通过在最适切割温度（O.C.T.）基质中迅速冷冻第三个T47D细胞沉淀制备而成。冷冻块在-80°C保存了一周，然后修剪以去除冷冻细胞沉淀中的过量O.C.T基质，并提取新鲜冷冻DNA。
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结直肠癌组织冷冻样本：在手术后送达组织病理学实验室后立即使用液氮进行冷冻。样本在-80°C保存，最长不超过2个月，然后在切片时使用冷冻切片机进行切割。切片后立即提取DNA。
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结直肠癌FFPE样本：结肠癌FFPE组织在固定在10%甲醛中平均16小时后，嵌入石蜡之前。石蜡块在室温存储最长不超过2个月，然后进行切片。DNA随后在切片后的一周内提取。
通过对FFPE和新鲜冻存的临床样本提取到的DNA进行比较，如图1，1-3孔的FFPE样本完全失去了大片段的DNA，4-6孔是新鲜冻存样本。8孔是T47D的新鲜细胞，9孔是snap-frozen O.C.T包埋的T47D细胞，7孔是FFPE T47D细胞，降解程度高。
结论：FFPE使得提取的DNA质量降低。
作者还比较了aCGH得到的结果。
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结论：扩增和删除是均匀的增多，变异没有染色体区域的偏好。
结论：新鲜和冻存样本的拷贝数图谱是类似的，FFPE的图谱则包含很多噪音。
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FFPE样本中提取到的DNA进行片段化后，检查其大小的分布，发现部分样本意外出现非常大的片段，通过使用蛋白酶K的大量消化，最小化了蛋白结合物，并允许对有用的DNA模板进行最大程度的恢复。通过处理获得主要为200-600 bp的碎片DNA段，如图1b所示。
aCGH检测拷贝数变化受到肿瘤纯度的影响，这里以8号染色体区域的扩增和删除为例，大片段的区域几乎不受到影响，但是较小的删除事件则只能在超过50%的肿瘤纯度中检测出来。
该文章对结直肠癌细胞系样本、结直肠癌临床样本都进行了新鲜样本和FFPE样本的对比，已知细胞系HCT116具有10q的扩增，以及10q端部定义模糊的变异，细胞系SW480具有SMAD4基因四探针纯合缺失（绿色都是缺失，红色都是扩增）：
通过ADM-1算法（Agilent，Inc）在样本103和样本549中，在来自分割样本、新鲜冷冻和FFPE部分的DNA提取中表现出几乎相同的基因剂量测量。FFPE相对于新鲜冷冻显示出中等增加的信号“噪音”，但与高分辨率基因视图）显示的扩增子长度和轮廓相同。在样本549中，PTEN纯合缺失在整个染色体10的半合子缺失背景中被同样检测到。在样本103中，通过包含ABI-1的10p扩增子检测到两个明显的扩增子。红色和绿色阴影区域显示了拷贝增益和丧失的范围。灰色方框指示基因的位置：
总结：拷贝数变异差别不大，主要是FFPE样本中噪音水平增加。
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FFPE和新鲜样本得到的拷贝数图谱是类似的：
其中染色体5和11上存在异常，作者认为可能是由肿瘤异质性引起的。但是FFPE的方差更高，另外新鲜样本中配对read大约是70%，FFPE大约是65%，理论上FFPE组织使用二代测序检测CNA需要更多的测序read。